치면생물막(dental biofilm)과 관련된 다양한 구강질환 중에서 치아우식은 가장 흔하게 발생할 뿐만 아니라 사회적, 경제적으로 막대한 손실을 초래하고 있다¹⁾. 치아우식은 식이 탄수화물의 세균 발효에 의한 치아 조직의 국소적 탈광화 작용으로 정의할 수 있다. 치면생물막에 존재하는 다양한 산생성 세균 중에서도 Streptococcus mutans (S. mutans)는 치아우식과 관련하여 가장 중요한 세균으로 인식되고 있다. S. mutans는 당(sugar)을 이용하여 다량의 산을 생성할 수 있을 뿐만 아니라, 주위환경의 pH가 낮을 때에도 다양한 생리학적 활동을 통하여 치면 생물막에서 생존할 수 있다²⁾. 또한, glucosyltransferase를 생산하여 자당(sucrose)을 세포외 다당류(extracelluar polysaccharide)로 변화시켜 생존하는데 유리한 환경을 조성할 수도 있다³⁾. 위와 같은 특징으로 인하여 치면생물막 내에서의 S. mutans의 역할 및 기능은 오늘날까지도 치아우식과 관련하여 중요한 연구 주제가 되고 있다.

오늘날 맛이나 기타 목적을 위해 식품에는 다양한 당이 첨가되고 있다. 음식물뿐만이 아니라 음료에도 당이 첨가되어 사용되고 있다. 특히, 탄산음료 또는 청량음료(carbonated drink or soft drink)로 알려진 이산화탄소 함유 음료에는 다량의 당이 맛을 좋게 하려는 목적으로 사용되고 있다. 이러한 탄산음료는 당 일일 섭취량 증가의 주요 원인 중 하나이다⁴⁾. 전 세계적으로 탄산음료의 소비량은 지속적으로 증가한다는 보고는 과거부터 존재했다. 1970년과 1996년 사이에 미국에서 탄산음료의 1인당 소비량은 23% 정도 늘었으며⁵⁾ 총 칼로리 양은 13.2-15.8% 증가했다⁶⁾. 이러한 음료 소비 양상의 변화 즉 탄산음료 소비와 치아우식 사이의 연관성은 잘 연구되지 않았다. 당 섭취와 영구치 치아우식 경험 사이의 연관성은 잘 기록되어 있지만⁷⁾, 탄산음료 소비와 치아우식 발생의 관계는 덜 명확하다. 일부 연구에서는 유의미한 연관성을 보고했지만^8,9) 다른 연구에서는 그렇지 않았다¹⁰⁾.

탄산음료에 의한 치아 손상은 탄산음료의 두 가지 성질로 인해 발생한다고 알려져 왔다. 첫째, 일부 음료의 낮은 pH와 높은 적정 산도는 법랑질 표면의 부식(erosion)을 유발할 수 있다¹¹⁾. 탄산음료의 부식 가능성은 낮은 pH와 음료의 완충 능력을 비롯한 여러 요인과 관련이 있는 것으로 생각된다. 탄산음료에는 낮은 pH 값에 기여하는 여러 유형의 산이 포함될 수 있다. 일부는 내재적으로 제조에 사용되는 천연 성분에서 파생될 수도 있으며, 음료의 관능적 특성을 증진하기 위한 제조 공정 중에 산이 생성되기도 한다. 이러한 단점을 극복하기 위하여 탄산음료 구성성분의 변경과 관련된 다양한 노력이 시도되기도 했다¹¹⁾.

두 번째로 탄산음료의 당은 치면생물막 세균에 의해 대사되어 유기산을 생성하여 치아우식을 유발할 수도 있다. 탄산음료에는 일반적으로 고농도의 자당, 포도당 또는 과당이 포함되어 있으므로 치아우식 유발 가능성과 관련된 연구가 시행되는 것은 당연하다. 탄산음료 섭취와 치아우식 경험과의 연관성을 밝혀내기 위한 다양한 임상 및 역학 연구가 지금까지 시행되어왔지만^8-10), 탄산음료 섭취가 치면생물막에 미치는 영향에 대해서는 명확히 밝혀지지 않았다. 특히, 치아우식과 관련된 주요세균 중의 하나인 치면생물막 내 S. mutans의 산생성 양상에 대한 당 포함 탄산음료의 영향에 관한 연구는 찾아보기 힘든 실정이다.

본 연구는 인공 치아우식 유발성 생물막인 S. mutans biofilm의 산생성 능력에 대한 당 포함 또는 당 비포함 탄산음료의 영향을 파악하기 위해 시행되었다.

1. 실험에 사용된 탄산음료

본 연구에서는 Table 1에서 볼 수 있듯이 코카콜라, 코카콜라 zero sugar, 스프라이트, 스프라이트 zero sugar 및 환타를 포함하는 5종의 탄산음료를 사용하였으며, 양성대조군으로 1% 자당(실험 최종농도)과 음성대조군으로 3차 증류수를 사용하였다. 실험에 사용된 탄산음료는 지역 식료품점에서 구매하였으며, 실험 시행 직전에 개봉하여 사용하였다. 탄산음료는 일반인들이 얼마나 흔하게 섭취하는가에 따라, 또 당류의 포함 여부에 따라 선택하였다. 각각의 탄산음료에 포함된 당 농도는 서로 달랐으며, 스프라이트가 112.7 mg/ml (11.3%)로 가장 높은 농도를 보였으며 그다음으로 코카콜라 108 mg/ml (10.8%), 환타 48 mg/ml (4.8%)의 농도를 보였다. 코카콜라 zero sugar와 스프라이트 zero sugar는 0%의 당 농도를 보였다. 스프라이트 zero sugar에서는 당 대신 당 알코올인 에리스리톨을 첨가하였으며, 코카콜라 zero sugar는 첨가된 감미료 성분을 표기하지 않았다.

Table 1 . Nutrient information of carbonated drinks used in the present study

	Coca cola	Coca cola zero sugar	Sprite	Sprite zero sugar	Fanta orange flavor
Volume (ml)	250	355	355	500	250
Calories (Kcal)	108	0	160	0	48
Sodium (mg)	8	22	33	16	8
Carbohydrates
Sugars (g)	27	0	40	0	12
Erythritol (g)	0	0	0	1	0
Fat
Trans fat (g)	0	0	0	0	0
Saturated fat (g)	0	0	0	0	0
Cholesterol (mg)	0	0	0	0	0
Protein (g)	0	0	0	0	0

2. S. mutans biofilm 형성과 실험설계

본 연구에서 사용된 균주는 S. mutans UA159 (ATCC 700610; serotype c)이며, S. mutans 생물막 산생성에 대한 탄산음료의 영향을 분석하기 위해 Fig. 1A와 같은 실험설계를 구상하였다.

Figure 1. Streptococcus mutans biofilm formation and experimental scheme for the present study. (A) Experimental scheme and pH adjustment of the test drinks for the determination of S. mutans biofilm acid production. (B) pH of the test carbonated drinks before pH adjustment. (C) pH of the test carbonated drinks after adding to salt solution. Coke, 0-coke, 0-sprite are abbreviations of Coca cola, Coca cola zero sugar, and Sprite zero sugar, respective.

S. mutans 생물막은 24-well plate에 hydroxyapatite (HA) disc (2.93 cm²; Clarkson Chromatography Products, Inc., South Williamsport, PA, USA)를 수직으로 위치시킨 후(1개 disc/well) 형성하였으며, 본 연구에서는 타액코팅을 하지 않았다는 것을 제외하고 나머지 방법은 과거 Pandit 등의¹²⁾ 연구에서 사용된 방법과 동일하였다. S. mutans UA159 (2-5×10⁶ colony-forming units [CFU]/ml, 2.8 ml/disc)와 1% sucrose (w/v) ultrafiltered (10 kDa molecular weight) tryptone yeast-extract broth가 담겨있는 24-well plate에 HA disc를 옮겨 생물막 형성을 시작하였다. 생물막이 안정화되도록 22시간 동안 배양한 후 이때부터 하루에 2번(오전 9시, 오후 6시) 실험기간 동안 배지를 교체하였다(Fig. 1A). 50시간 된 S. mutans 생물막을 20 mM 인산칼륨 완충액(pH 7.2)에서 1시간 동안 배양하여 내인성 대사산물을 고갈시킨 후 51시간 된 S. mutans 생물막의 산생성을 측정하였다.

3. pH 조정

본 연구에서는 S. mutans 생물막의 산생성을 측정하기 위하여 6-well plate를 사용하였으며, S. mutans 생물막의 산생성 측정에 앞서 탄산음료들의 pH 값 차이로 인한 영향력의 차이를 제거하기 위하여, 탄산음료를 투입하였을 때의 pH를 7.0으로 조정하였다. 먼저, 탄산음료가 갖는 본래의 pH 값을 측정하였다(Fig. 1B). 그 후, 본 실험을 위하여 1개 well 당 salt solution (50 mM KCl+1 mM MgCl₂, pH 7.0) 11.4 ml에 탄산음료 600 μl를 넣어주고 다시 pH를 측정하였다(Fig. 1C). Salt solution에서의 탄산음료 pH를 측정한 후, KOH를 이용하여 pH가 7.0에 이를 때까지 조정하였다. 전체적으로, 12 ml에서 스프라이트는 약 0.56%로 가장 높은 당 농도를 보였으며 그다음으로 코카콜라는 약 0.54%, 환타는 약 0.24%를 보였다(실험 최종농도).

4. Biofilm 산생성 능력 측정

S. mutans 생물막 산생성 능력은 Belli 등의¹³⁾ pH drop assay를 사용하여 측정하였다(Fig. 1A). 51시간 S. mutans 생물막을 salt solution과 탄산음료가 담겨있는 6-well plate에 옮긴 후 glass electrode를 사용하여 산생성 정도를 60분 동안은 10분 간격으로 측정하였다. 60분 이후로는 90분과 120분에서 측정하였다. 생물막 산생성 능력을 명확히 파악하기 위하여 실험에서 얻어진 pH하강 곡선 중 0-30분까지의 자료를 이용하여 수소이온 생성 초기 속도를 계산하였으며, pH 하강이 종결되었다고 여겨지는 120분의 자료를 이용하여 수소이온 전체 생산 농도를 계산하였다. 수소이온 생성 초기 속도=(30분에서의 H⁺ 농도^―0분에서의 H⁺의 농도)/30에서 유도되었으며, 전체 생산 수소이온 농도=(120분에서의 H⁺ 농도^―0분에서의 H⁺농도)에서 유도되었다.

5. 통계분석

본 연구의 모든 실험은 최소 6번의 독립적인 반복 실험을 시행하였으며 모든 자료는 평균±표준편차로 표시하였다. 집단간 차이를 분석하기 위해 일원변량분석을 시행하였으며, 사후검증을 위해 Tukey test를 이용하였다. P 값이 0.05 보다 작은 경우를 통계적으로 유의하다고 판단하였다.

1. 탄산음료의 pH 값

Fig. 1B에서 볼 수 있듯이, 실험에 사용된 각각의 탄산음료의 pH 값은 서로 달랐다. 코카콜라는 평균 2.44로 가장 낮은 pH 값을 보였으며, 그다음으로 환타는 평균 2.61, 코카콜라 zero sugar는 평균 2.62, 스프라이트 zero sugar는 평균 2.84, 스프라이트는 평균 3.04의 pH 값을 보였다. 전체적으로 탄산음료는 당류의 첨가 여부와 관계없이 약 3 이하의 낮은 pH 값을 보였다. 11.4 ml salt solution에 각각의 탄산음료 600 μl를 넣어주었을 때의 pH 값은 각각의 탄산음료가 갖는 pH 값 보다 약 1 정도씩 높게 나타났다. 환타를 첨가한 경우에는 평균 3.57, 코카콜라를 첨가한 경우에는 평균 3.84, 코카콜라 zero sugar를 첨가한 경우에는 평균 4.06, 스프라이트 zero sugar를 첨가한 경우에는 평균 3.78, 스프라이트를 첨가한 경우에는 평균 3.92의 pH 값을 나타냈다(Fig. 1C).

2. pH drop assay에서의 pH 하강 곡선

Fig. 2에서 볼 수 있듯이, 각각의 탄산음료에 대한 S. mutans 생물막의 산생성은 완전히 다른 양상을 보인다. 당류가 포함되지 않은 코카콜라 zero sugar, 스프라이트 zero sugar와 물(3차 증류수)은 실험시간(0-120분) 동안 pH는 아주 서서히 하강하였을 뿐만 아니라 거의 직선 형태의 양상을 보였다. 또한, 실험시간 120분에 나타나는 이것들의 최종 pH는 치아우식 발생과 깊은 관계가 있는 critical pH 이하로는 내려가지 못하였다. 실험시간 30분에서나 120분에서 코카콜라 zero sugar, 스프라이트 zero sugar는 음성대조군인 물과 유사한 pH를 보였다(P>0.05). 반면에, 당류가 포함된 코카콜라, 스프라이트, 환타 및 양성대조군인 1% 자당의 pH는 초기에 급격히 하강하였을 뿐만 아니라 실험시간 30분에는 critical pH 미만으로 떨어졌다. 하지만, 실험 후기로 갈수록 pH는 아주 서서히 하강하였을 뿐만 아니라 거의 직선 형태의 양상을 보였다. 실험시간 30분에서 1% 자당과 코카콜라의 pH 값은 유사하였으며(P>0.05), 120분에서는 모든 당류 포함 탄산음료와 1% 자당의 pH 값은 유사하였다(P>0.05).

Figure 2. Influence of carbonated drinks on the acid production of 51-hour-old Strptococcus mutans biofilm cells. Values followed by the same superscript are not significantly different from each other (P>0.05). Coke, 0-coke, 0-sprite are abbreviations of Coca cola, Coca cola zero sugar, and Sprite zero sugar, respective.

3. 수소이온 생성 초기 속도와 당 농도와의 관계

본 연구에서는 로그함수에 기반을 둔 pH 값 대신 수소이온농도를 계산하여 산생성 속도를 측정하였다. 세균의 산생성은 당을 투입하자마자 급격히 일어나기 때문에 실험시간 0-30분까지의 산생성 속도를 측정하여 초기속도로 정의하였으며, Fig. 3A에 이를 보여주고 있다. 당이 포함되지 않은 탄산음료의 수소이온 초기 생성 속도는 거의 0에 가까웠으며, 당이 포함된 경우는 탄산음료의 종류에 따라 상이하게 나타났다. 특히, 코카콜라의 수소이온 초기 생성 속도는 양성 대조군인 1% 자당과 차이가 없었다(P>0.05). Fig. 3B는 본 실험에 사용된 각각의 탄산음료 600 μl에 포함된 당의 농도(최종 실험농도)와 수소이온 초기 생성 속도의 관계를 1차 함수로 선형적합(linear fitting)시킨 그림이다. 그림에서 볼 수 있듯이 당 농도와 수소이온 초기 생성 속도는 선형으로도 충분히 설명할 수 있었으며(Y=3.15X+0.0072), 이의 결정계수는 약 0.93이었다.

Figure 3. Initial rate of hydrogen production by Streptococcus mutans biofilms treated with carbonated drinks. (A) Initial rate of hydrogen production by 51-hour-old Streptococcus mutans biofilms treated with carbonated drinks. (B) Relationship between initial rate of hydrogen production by 51-hour-old Streptococcus mutans biofilms and sugar concentration (the final concentrations tested) of carbonated drinks. Values followed by the same superscript are not significantly different from each other (P>0.05). Coke, 0-coke, 0-sprite are abbreviations of Coca cola, Coca cola zero sugar, and Sprite zero sugar, respective.

4. 전체 생산 수소이온 농도와 당 농도와의 관계

전체 실험시간 0-120분까지의 산생성 농도를 측정하여 전체 생산 수소이온 농도로 정의하였으며, Fig. 4A에 이를 보여주고 있다. 당이 포함되지 않은 탄산음료의 전체 생산 수소이온 농도는 수소이온 초기 생성 속도와 유사하게 거의 0에 가까웠으며, 당이 포함된 경우는 탄산음료의 종류에 따라 상이하게 나타났다. 특히, 코카콜라의 전체 생산 수소이온 농도는 양성 대조군인 1% 자당보다 높게 나타났으며(P<0.05), 스프라이트의 전체 생산 수소이온 농도는 양성 대조군인 1% 자당과 차이가 없었다(P>0.05). Fig. 4B는 본 실험에 사용된 각각의 탄산음료 600 μl에 포함된 당의 농도(최종 실험농도)와 전체 생산 수소이온 농도의 관계를 1차 함수로 선형적합(linear fitting)시킨 그림이다. 그림에서 볼 수 있듯이 당 농도와 수소이온 초기 생성 속도는 선형으로도 어느 정도 설명할 수 있었으며(Y=104.9X+14.8), 이의 결정계수는 약 0.74였다.

Figure 4. Total produced concentration of hydrogen ion by Streptococcus mutans biofilms treated with carbonated drinks. (A) Total produced concentration of hydrogen ion by 51-hour-old Streptococcus mutans biofilms treated with carbonated drinks. (B) Relationship between total produced concentration of hydrogen ion by 51-hour-old Streptococcus mutans biofilms and sugar concentration (the final concentrations tested) of carbonated drinks. Values followed by the same superscript are not significantly different from each other (P>0.05). Coke, 0-coke, 0-sprite are abbreviations of Coca cola, Coca cola zero sugar, and Sprite zero sugar, respective.

청량음료가 전신 및 구강 건강에 부정적인 영향을 미친다는 것은 잘 알려져 있다¹⁴⁾. 탄산음료 섭취와 치아우식 위험 사이에는 양의 상관관계가 나타나기도 했으며¹⁵⁾, 탄산음료 섭취율이 높은 어린이의 경우 더 높은 치아우식 발생률을 보여주기도 했다. 또한, Bowen 등¹⁶⁾은 콜라의 치아우식 유발성이 자당보다 높다고 보고했다. 이러한 치아우식 유발성의 주요 원인 중 하나는 대부분의 비다이어트 청량음료에 존재하는 치아우식 촉진 당류인 HFCS (high fructose corn syrup)의 존재 때문일 수 있다¹⁷⁾. 과당 55%와 포도당 45%의 혼합물인 HFCS는 최근 음료, 빵, 유제품 및 통조림 품목에 널리 첨가되고 있다¹⁸⁾. 미국에서는 현재 음료의 70%에 HFCS를 포함하고 있으며, 식품 첨가물로서 HFCS의 섭취 증가와 관련된 건강 영향에 대한 관심이 높아지고 있는 실정이다¹⁸⁾. 본 연구에서는 코카콜라와 양성대조군으로 사용된 1% 자당의 실험 최종 당 농도에 있어 차이(코카콜라: 약 0.54%)를 보이지만 수소이온 초기 생산속도에서는 차이가 없었다(Fig. 3A). 또한, 전체 생산 수소이온 농도에서는 오히려 1% 자당보다 당 농도가 낮은 코카콜라가 더욱 높게 나타났다(Fig. 3A). 본 연구의 이러한 결과는 HFCS의 치아우식 유발성에 대해 언급한 과거의 연구를 뒷받침하고 있다. 하지만, HFCS의 치아우식 유발성에 대한 보다 과학적인 기전 및 영향력 파악을 위해서는 치면생물막에서의 치아우식 관련균의 생리학적 활성 및 세균 구성에 대한 HFCS의 깊이 있는 영향력 연구가 선행되어야 가능할 것으로 생각한다.

당과 탄수화물이 구강에 노출되는 동안 치면생물막 치아우식 관련 세균은 이를 산으로 전환하기 시작한다. 세균에 의해 생산된 산은 pH를 하강시키며, 치아의 탈광화는 치아 외부에 있는 생물막의 pH가 critical pH 값으로 알려진 5-5.5 미만일 때 발생한다¹⁹⁾. 본 연구에서 S. mutans 치면생물막은 당 포함 탄산음료와 1% 자당을 첨가한 경우 약 20분이 지난 후부터 pH 값은 critical pH 영역 아래로 떨어진다(Fig. 2). 하지만, 당이 포함되지 않은 탄산음료와 3차 증류수는 시간이 흘러도 pH 값은 급격하게 변하지 않으며 critical pH 영역 근처에 다다르지 못했다. 이러한 결과는 치면생물막 속의 S. mutans는 탄산음료에 포함된 당을 해당작용에 이용하여 유기산을 생성할 뿐만 아니라 치아 조직을 탈광화 시킬 정도로 pH를 낮출 수 있다는 사실을 명확히 보여주고 있다. 또한, Fig. 1A에 보여주듯이 탄산음료 원래의 pH는 당류 첨가 여부와 관계없이 약 3 이하의 낮은 값을 보여주기 때문에, 당이 포함되지 않은 탄산음료는 치면생물막 속에 존재하는 세균에 의한 산생성 때문에 발생하는 치아우식보다는 탄산음료 자체의 낮은 pH 값에 의해 유발되는 치아부식(dental erosion)이 더 큰 구강 건강 문제일 수 있다는 것을 암시한다. 전체적으로, 이러한 결과는 구강 건강과 관계된 예방적 측면에서 당이 첨가된 탄산음료는 치아우식과 치아부식 모두를 고려해야 하고, 당이 첨가되지 않은 탄산음료는 치아부식에 좀 더 무게중심을 두어야 한다는 것을 제시하고 있다.

본 연구에서는 S. mutans 치면생물막의 산생성과 탄산음료의 당 농도의 관계를 1차함수를 이용하여 분석하였다. 수소이온 초기 생성 속도뿐만 아니라 전체 생산 수소이온 농도도 당 농도와 positive한 선형적인 관계를 보여주고 있다(Fig. 3B, 4B). 이러한 결과는 S. mutans 치면생물막의 산생성 속도뿐만 아니라 전체 pH 변화에도 영향을 미치고 있다는 것을 명확하게 보여주고 있다. 더욱, 수소이온 초기 생성 속도와 당 농도, 전체 생산 수소이온 농도와 당 농도의 1차 함수관계에서의 결정계수는 각각 약 0.93과 0.74를 보였다(Fig. 3B, 4B). 이러한 각각의 결정계수는 당 농도가 수소이온 초기 생성 속도의 변화를 93% 정도, 전체 생산 수소이온 농도의 변화를 74% 정도 설명할 수 있다는 것을 이야기하고 있다. 전체적으로, 본 연구에서는 S. mutans 치면생물막의 산생성은 탄산음료의 당 농도와 명확히 관련되어 있는 것을 보여주고 있다.

Fig. 2에서 볼 수 있듯이, 본 연구에서는 당이 첨가되지 않은 탄산음료나 음성대조군인 3차 증류수를 S. mutans 치면생물막에 처리한 경우에도 산이 생성되었다. 이러한 현상은 mutans streptococci의 세포내 다당류 합성 능력과 관계될 것으로 생각된다. 과거의 연구에 따르면 mutans streptococci는 과도한 당이 있을 때 세포 내 다당류를 합성할 수 있다. 이러한 세포 내 다당류는 탄수화물 저장고 역할을 할 수 있으며 식이 탄수화물을 사용할 수 없는 기간 동안 산으로 전환될 수 있으므로, S. mutans의 치아우식관련 중요 독성인자로 간주되고 있다²⁰⁾. 더욱, 세포 내 다당류 합성이 결핍된 S. mutans는 동물실험에서 치아우식이 적게 발생하였다. 본 연구에서는 50시간 된 S. mutans 생물막의 내인성 대사산물(즉, 세포 내 다당류)을 고갈시키기 위하여 20 mM 인산칼륨 완충액(pH 7.2)에서 1시간 동안 배양하였지만, 대사산물이 완벽하게 제거되지 않았기 때문에 발생하는 현상이라 생각할 수 있다.

본 연구에서는 탄산음료 자체의 pH 차이에 의해 발생하는 변수를 제거하기 위하여 S. mutans 치면생물막의 산생성 능력을 측정하기에 앞서 탄산음료를 포함하는 salt solution의 pH를 7로 조정하였고(Fig. 1A), 탄산음료에 포함되어 있는 당의 농도에 따라 산생성은 달라진다는 것을 보여주고 있다(Fig. 3B, 4C). 하지만, 사람들이 pH가 조정된 탄산음료를 섭취하는 것이 마시는 것이 아니고, 낮은 pH는 치면생물막 세균의 생리적인 활성 및 다양성에 다양한 영향을 미친다는 과거의 연구결과를 고려해보았을 때²¹⁾, pH가 조정되지 않은 상태에서 탄산음료가 치면생물막의 산생성, 구조, 구성성분 및 생리 활성 등에 미치는 연구가 필요하다고 생각한다.

본 연구는 인공 치아우식 유발성 생물막인 S. mutans biofilm의 산생성 능력에 대한 당 포함 또는 당 비포함 탄산음료의 영향을 파악하기 위해 시행되었다. 이를 위해 S. mutans로 구성된 51시간 생물막을 형성한 후, 코카콜라, 코카콜라 zero sugar, 스프라이트, 스프라이트 zero sugar 및 환타를 포함하는 5종의 탄산음료와 음성대조군인 3차 증류수와 양성대조군인 1% 자당의 생물막에서의 산생성 능력을 파악, 비교하여 다음과 같은 결론을 얻었다.

1. 실험에 사용된 각각의 탄산음료의 pH 값은 서로 달랐지만 2.4-3.1의 범위에 포함되었다.

2. 당이 포함되지 않은 탄산음료와 음성대조군은 S. mutans 생물막 산생성으로 인한 pH 값을 critical pH 이상에서 유지되게 하였다.

3. 당이 포함된 탄산음료와 양성대조군은 S. mutans 생물막 산생성으로 인한 pH 값을 critical pH 미만으로 하강시킨 후 유지되게 하였다.

4. S. mutans 생물막 산생성과 탄산음료에 포함된 당의 농도는 서로 밀접하게 관련되어 있었다.

이상의 결과를 종합하건대, 구강 건강과 관계된 예방적 측면에서 당이 첨가된 탄산음료는 치아우식과 치아부식 모두를 고려해야 하고, 당이 첨가되지 않은 탄산음료는 치아부식에 좀 더 무게중심을 두어야 한다는 것을 제시하고 있다. 하지만, 실제 치아우식관련 치면생물막은 S. mutans 단일 균종으로 이루어지고 있지 않다는 사실을 고려해보았을 때, 보다 과학적인 결론을 내리기 위해서는 탄산음료가 다균종 치면생물막 혹은 실제 사람의 치면생물막의 산생성, 구조, 구성성분 및 생리 활성 등에 대한 탄산음료의 영향 연구가 필요하다고 생각한다.