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J Korean Acad Oral Health 2023; 47(4): 155-159

Published online December 30, 2023 https://doi.org/10.11149/jkaoh.2023.47.4.155

Copyright © Journal of Korean Academy of Oral Health.

A quantitative comparison of oral microbiota using various sample collection methods: a pilot study

Sang-Uk Im1 , Ji-Hye Kim1,2 , Keun-Bae Song1 , Youn-Hee Choi1,2

1Department of Preventive Dentistry, School of Dentistry, Kyungpook National University,
2Institute for Translational Research in Dentistry, Kyungpook National University, Daegu, Korea

Correspondence to:Youn-Hee Choi
Department of Preventive Dentistry, School of Dentistry, Kyungpook National University, 2177 Dalgubeol-daero, Jung-gu, Daegu 41940, Korea
Tel: +82-53-660-6871
Fax: +82-53-423-2947
E-mail: cyh1001@knu.ac.kr
https://orcid.org/0000-0001-5712-8097

Received: September 7, 2023; Revised: September 21, 2023; Accepted: October 4, 2023

This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/), which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Objectives: This study aimed to compare each strain’s number of microorganisms found in oral samples collected using various collection methods.
Methods: Twenty-two adults aged 40 and above participated in the study. Oral samples were collected from subjects using three different methods (stimulated saliva, oral biofilm, and calculus), and the collected samples were analyzed using the multiplex real-time Polymerase chain reaction (PCR) method.
Results: The study included 22 subjects (2 men, 20 women) with an age range of 40-75 years. Healthy oral condition was observed in 10 subjects, while the remaining 12 had periodontitis. The saliva and biofilm collection methods for oral microorganisms detected Porphyromonas gingivalis (Pg), Tannerella forsynthesis (Tf), and Fusobacterium nucleatum (Fn), which are the causative bacteria of periodontal disease, more effectively compared with the calculus group. In addition, the saliva group showed a better ability to detect Streptococcus mutans (Sm) which causes dental caries, compared with the biofilm and calculus groups. Comparisons based on the presence or absence of periodontitis and the collection method revealed a statistically significant difference in the number of oral microorganisms only in case of Sm strain.
Conclusions: The frequency of expression of certain strains varies according to the method of collection of oral microorganisms. Further, the saliva and biofilm methods of collecting oral microorganisms are more suitable for quantitative analysis of bacteria causing periodontal disease.

Keywords: Biofilm, Calculus, Collection methods, Oral microorganisms, Saliva

인간의 구강 내에는 매우 다양하고 복잡한 미생물 군집이 모여 있으며 이들의 적절한 균형상태가 구강 건강을 유지하는데 중요한 역할을 담당한다1). 구강미생물은 타액이나 치면세균막, 치석 등 다양한 구강 내 부위에서 발견될 수 있으며, 구강미생물의 채취는 구강 내 미생물 군집과 구강건강 및 전신건강에 미치는 영향을 연구하는데 필수적2)이다.

Socransky와 Haffajee3)의 연구에 따르면, 치주질환에 미치는 영향과 치면세균막의 형성시기에 따라 구강 내 미생물을 5가지로 분류하였다. 또한, 치은연하 치면세균막 내 세균이 일정한 수 이상으로 증가하는 경우 치주질환과 관련된 병원성을 나타내며, 세균의 집락, 염색반응, 색소 생성, 상호 연관성 등의 특징을 바탕으로 red, orange, yellow, green, and purple complex의 5가지로 분류4)하였다. 이들 중 병원성이 가장 강한 고위험세균인 Red complex는 Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Treponema denticola 등이 있고, orange complex는 Fusobacterium nucleatum, Prevotella intermedia, Prevotella nigrescens 등이 있다. 이들은 치은염 및 치주염과 밀접한 관련이 있다. 또한 yellow complex의 대표적인 미생물인 Streptococcus mutans는 충치의 주요 원인균이다.

Multiplex real-time PCR 방법5-7)은 충치, 치은염, 치주염 등을 유발하는 구강 및 치주 질환과 관련된 구강세균을 다중 실시간 중합효소 연쇄반응 기법을 통해 해당 미생물만 선택적으로 증폭하여 정량적으로 확인 할 수 있는 분석하는 방법이다. Multiplex real-time PCR는 간단하고 안전하게 구강 및 치주질환과 관련된 미생물의 종류와 그 양을 정확하게 파악할 수 있다7,8).

일반적으로 구강미생물을 정량화하는 방법은 타액에 존재하는 구강미생물을 10 ml의 가글액을 1분간 가글하여 이를 DNA 소스로 사용하여 real-time PCR로 분석하는 방법9,10)이다. 그 외에도 면봉이나 스크레퍼 등을 이용하는 방법7) 등이 사용되고 있으나 정량적인 차이나 채취 방법에 따른 효과는 여전히 불분명하다. 또한 치은염이나 치주염의 원인균은 타액보다 치주낭이나 치면에서 직접 채취하는 것이 더 많은 미생물을 확인할 가능성이 있기 때문에 다른 채취 방법의 효율성도 함께 고려해야 할 필요성이 있다.

그러므로 본 연구는 다양한 채취 방법으로 구강미생물을 정량적으로 분석하고 각각의 효율성을 비교해 보고자 하였다. 구체적으로 먼저 자극성 타액 및 microbrush 또는 curette을 이용한 치면세균막 또는 치석의 채취에서 구강미생물의 수적인 차이를 비교하고자 한다. 두번째로 대상자의 구강건강상태와 구강미생물 채취 방법 간에 상관관계가 있는지 확인하고자 한다.

1. 연구대상

본 연구는 경북대학교 치과병원 기관심사위원회(IRB No: KNUDH 2021-06-09-02)의 승인을 받았다. 본 연구의 대상자는 연구 참여에 동의하는 만 40세 이상의 성인 22명을 대상으로 하였다. 모든 대상자의 구강상태를 확인하기 위하여 숙련된 치과의사 1인이 구강검사를 실시하였다. 구강검사는 모든 치아의 6분면을 대상으로 실시하였으며 치주낭 깊이(probing pocket depth, PD)가 4 mm 이상인 치면이 1개 이상이거나 임상적 부착치은소실(clinical attachment loss, CAL)이 5 mm 이상인 치면이 1개 이상인 경우를 치주염으로 분류하였다.

2. 연구방법

2.1. 채취 방법

22명의 대상자로부터 각각 3가지 방법으로 구강 내 미생물을 채취하였다. 첫번째 방법(M1; 타액군)은 대상자에게 paraffin chewing wax를 1분 동안 저작하며 15 ml cornical tube에 자극성 타액을 모은 다음 그 중 1 ml를 가글액 10 ml와 섞어 시료 분석에 이용하였다. 두 번째 방법(M2; 치면세균막군)은 #16, #17, #36, #37 치아 사이를 microbrush (Disposable micro Applicators, TPC Advanced Technology, Inc., City of Industry, CA, USA)로 수회 문질러 1 ml 가글액이 들어있는 e-tube에 microbrush의 머리만 잘라 넣어 시료 분석에 이용하였다. 마지막 방법(M3; 치석군)은 #26, #27, #46, #47 대구치 치주낭에서 curette (Gracey curetter, DentArt Instruments MFG.Co., Sialkot, Parkistan)을 이용하여 치석을 3회 이상 긁어 1 ml의 가글액에 담아 시료 분석에 이용하였다. 모든 채취샘플은 시료 분석 전까지 4℃에서 냉장 보관하였다.

2.2. Multiplex real-time PCR

채취된 구강미생물 시료는 Denomics의 OBD (oral bacteria detection)를 통해 real-time PCR 방법을 이용하여 분석하였다. 간략하면, 시료에서 genomic DNA를 분리하고 각각 균주에 특이하게 결합하는 primer와 섞어 95℃, 10분간 denaturation 이후, 95℃, 15초, 60℃, 1분의 cycle을 통해 대략 200 bp 내외의 절편이 증폭되는 피크의 ct값을 확인하고 이를 정량식에 대입하여 검체 10 ml 당 정량값을 도출하였다. OBD 서비스를 통해 Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa), Porphyromonas gingivalis (Pg), Tannerella forsythia (Tf), Treponema denticola (Td), Prevotella intermedia (Pi), Fusobacterium nucleatum (Fn), Prevotella nigrescens (Pn), Streptococcus sobrinus (Ss), Streptococcus mutans (Sm), Lactobacillus casei (Lc) 등 총 10 종의 구강미생물의 정량 분석을 실시하였다. 수집된 구강미생물 자료 중 10 ml를 기준으로 하는 구강미생물 수를 log값으로 치환하여 나온 값을 평균 낸 다음 이를 분석에 이용하였다.

3. 통계분석

모든 데이터는 SPSS version 26.0 (IBM Co., Armonk, NY, SA)을 사용하여 분석하였으며, 통계적 유의성 판정을 위한 유의수준은 5%로 설정하였다. 각 채취방법에 따른 구강미생물 수를 비교하기 위해 Kruskal-wallis test를 실시하였고, Wilcoxon’s signed rank test로 사후분석한 후, 유의수준을 Bonferroni 방법으로 보정하여 해석하였다.

1. 대상자의 일반 특성

연구대상자들의 일반적인 특성은 다음과 같았다. 40세에서 75세 사이의 총 22명의 대상자 중 두 명은 남성이었고 나머지 20명은 여성이었으며, 10명은 구강상태가 건강한 대상자였고 나머지 12명은 치주염 환자였다(Table 1).

Table 1 . General characteristics of participants.

CharacteristicsN (%)
Total22 (100.0)
Age (yrs)
40-495 (22.7)
50-595 (22.7)
60-693 (13.6)
70-799 (40.9)
Sex
Male2 (9.1)
Female20 (90.9)
Oral health
Healthy10 (45.5)
Periodontal12 (54.5)


2. 채취 방법에 따른 구강미생물의 수 비교

Table 2Fig. 1은 각 채취 방법으로 수집된 샘플의 분석 결과 값 중 구강미생물의 수를 log값으로 치환하여 얻은 모든 대상자의 값을 평균값과 그 표준편차를 보여준다.

Figure 1. Average numbers of each bacteria according to sample collection methods. M1: Saliva group, M2: Biofilm group, M3: Calculus group. *There is a significant difference compared to M2 or M3 by Bonferroni corrected Wilcoxon’s rank sum test (P<0.05).

Table 2 . Average numbers of each bacteria according to sample collection methods.

MethodsM1M2M3P-value
Aa0.45±1.460.26±0.960.31±1.000.962
Pg6.33±0.81a7.10±1.10a5.41±1.15b0.004
Tf6.06±0.84a6.78±1.41a5.24±1.09b0.004
Td4.13±0.804.28±1.353.87±1.190.570
Fn7.34±0.56a7.39±0.75a6.60±0.91b0.004
Pi4.57±1.355.11±0.793.58±0.930.225
Pn7.24±0.757.15±1.037.29±1.370.739
Ss1.35±0.881.26±1.480.72±0.480.562
Lc2.28±0.741.34±0.790.96±0.700.191
Sm5.88±0.69a3.97±1.11b3.19±1.38b0.001

Values are mean±standard deviation..

P-value was analyzed by Kruskal-wallis test..

a,bSame letter means there is no significant difference by Bonferroni- corrected Wilcoxon’s rank sum test..

M1: Saliva group, M2: Biofilm group, M3: Calculus group..



구강미생물 수의 평균값에 대한 비교에서 Pg, Tf, Fn의 경우 타액군과 치면세균막군의 차이는 통계적으로 의미가 없었으나 타액군과 치석군 간, 그리고 치면세균막군과 치석군간의 차이는 유의미하였다. 또한 Sm의 경우 타액군과 치면세균막군 및 타액군과 치석군의 차이는 유의미하나 치면세균막군과 치석군간의 차이는 아무런 의미가 없었다.

Fig. 1은 다양한 채취 방법에 따른 각각의 구강미생물의 수를 보여주고 있다. X축의 총 10종의 구강미생물은 모든 대상자의 시료 10 ml당 구강미생물의 수를 계산하여 이를 log값으로 치환 후 평균한 값을 y축에 표기하였다. 타액을 이용한 구강미생물의 채취 방법(M1)은 모든 균주에서 전체적으로 고른 정량적 검출 능력을 보여주었으며, 특히 충치 유발세균인 Sm을 더 잘 검출하였다. 또한, microbrush를 이용한 구강미생물 채취 방법(M2; 치면세균막군)은 다른 방법보다 red complex (eg. Pg, Tf)를 잘 검출하는 경향이 있었다(Table 2, Fig. 1).

연구대상자들의 구강건강상태에 따라 건강한 그룹과 치주질환이 있는 그룹으로 구분하고, 구강건강상태에 따른 미생물의 숫자가 채취 방법에 따라 차이 나는지를 확인하였다. 건강한 사람과 치주질환이 있는 그룹간의 비교에서 치주질환의 주요 원인균인 Pg, Tf 등의 특별한 수적 차이를 확인하지 못했으나, 우식을 유발하는 Sm에서는 구강건강상태의 변화에 따라 채취 방법의 차이가 통계적으로 유의미함을 확인할 수 있었다(Table 3).

Table 3 . Average number of each bacteria according to sample collection methods by oral health.

MethodsAaPgTfTdFnPiPnSsLcSm
Healthy (N=10)
M10.53±1.685.65±3.055.44±2.074.25±2.987.31±0.585.04±3.647.48±0.581.15±2.432.21±2.895.87±0.65a
M20.36±1.145.98±3.305.86±2.504.08±3.597.32±0.794.59±4.037.53±1.211.08±2.341.21±1.944.84±1.17ab
M30.67±1.434.83±2.724.63±1.933.55±3.126.68±0.924.19±3.717.28±1.180.00±0.000.00±0.003.17±2.29b
P-value0.7960.1340.1230.610.1280.7710.6090.330.0750.015
Periodontal (N=12)
M10.39±1.346.90±2.316.59±0.784.04±3.617.36±0.564.19±3.867.05±2.381.51±2.792.34±2.945.88±0.75a
M20.00±0.006.77±2.346.62±1.114.09±3.216.96±0.683.34±4.157.07±2.331.11±2.590.89±2.092.92±2.65b
M30.00±0.005.89±2.195.75±1.054.14±2.766.53±0.933.07±3.817.30±1.571.32±3.081.77±2.222.76±3.03ab
P-value0.3680.0840.0540.8620.0560.7260.980.9140.3830.009

Values are mean±standard deviation..

P-value was analyzed by Kruskal-wallis test..

a,bSame letter means there is no significant difference by Bonferroni- corrected Wilcoxon’s rank sum test..

M1: Saliva group, M2: Biofilm group, M3: Calculus group..


본 연구는 자극성 타액과, 치면에서 microbrush로 채취한 치면세균막, 그리고 대구치 치주낭에서 curette으로 채취한 치석 등 3가지 채취 방법에 따른 구강미생물 수를 multiplex real-time PCR 방법을 통해 그 수를 비교하고자 하였다. 이미 보고된 대로, 다양한 구강미생물의 정량적 분석 방법 중 multiplex real-time PCR 방법이 다른 방법에 비해 구강미생물 수를 가장 높게 측정해 낼 수 있었기 때문에8) 채취하는 방법에 따른 구강미생물 수의 비교에 가장 적합한 분석방법이었다.

연구대상자들은 40세에서 75세 사이의 22명의 대상자로 20명은 여성이었고 2명은 남성이었다. 10명은 구강상태가 건강한 대상자였고 나머지 12명은 치주염 환자였다(Table 1).

Table 2Fig. 1에 따르면, Pg, Tf, Fn의 구강미생물 수의 경우 치석군에 대한 치면세균막군과 타액군 간에 상당한 차이가 있었으며, 이러한 결과는 치석에 비해 타액과 치면세균막에서 채취하는 방법이 치주염 관련 미생물(Pg, Tf, Fn)을 보다 효과적으로 검출할 수 있음을 의미한다. 또한 microbrush를 이용한 치면세균막의 채취는 다른 방법보다 red complex (e.g. Pg, Tf)를 잘 검출하는 경향이 있었다(Table 2, Fig. 1). Cho5)의 이전 연구 결과에서도, Pg와 Tf는 다른 구강미생물에 비해 상대적으로 높은 출현율을 보였다. 타액을 이용한 구강미생물의 채취 방법(M1)은 전반적으로 모든 구강미생물의 정량적 검출정도가 양호함을 보여주었으며, 특히 우식을 유발하는 Sm을 더 효과적으로 잘 검출하였다. 이는 구강미생물의 채취 방법에 따라 특정 구강미생물 수의 검출 정도 차이가 있음을 나타내며, 이는 균주를 채취하는 방법에 따라 특정 질환을 일으키는 구강미생물의 정량적 분석에 영향을 미칠 수 있음을 의미한다.

연구대상자들의 일반 특성 중 연령별(data not shown) 또는 구강건강상태에 따른 구강미생물 수(Table 3)에 대한 결과에 따르면 일반 특성의 차이에 따라 구강미생물 수가 확연하게 차이나는 경우는 확인할 수 없었다. 특히 치주질환의 주요 원인균주인 Pg, Tf 등의 산술적인 차이는 확인할 수 있었으나 통계적으로 의미있는 값을 확인하지 못했다. 이전 연구9,10)에서 치주질환과 치주염 유발 세균의 수의 관계를 분석한 결과, Pg와 Tf의 수가 치주질환의 발생에 따라 그 수의 증가가 유의미함을 확인할 수 있었는데 반해, 이번 연구에서는 통계적으로 의미있는 값을 확인하지 못하였다.

하지만, Sm 균주의 경우, 각각의 채취 방법에 따라 그 수가 통계적으로 유의미하게 차이남을 확인할 수 있었다. 이는 Sm은 통성혐기성 균으로 구강 내 대부분에 존재하므로, 타액을 채취하는 방법이 해당 균주를 검출하는데 가장 효과적인 방법일 것으로 생각된다.

본 연구는 몇 가지 제한점이 있었다. 먼저, 연구대상자 수가 너무 적었고 모집 방법이 편의성 채취 방법이었기 때문에 성별, 나이, 치주염 정도 등이 고르게 분포되지 않아 결과를 일반화하기 어렵다. 이러한 이유로 이전 연구9,10)와 다르게 Pg, Tf 등의 정량적인 차이를 확인하지 못한 것이라 사료된다. 또한, 동일한 대상자에 타액, 치면세균막, 치석 등 총 3회의 채취 방법을 순서대로 실시하여 실제 구강 내 존재하는 미생물의 분포상황을 제대로 반영하지 못했을 가능성을 배제할 수 없다. 마지막으로 따라서 더 나은 결과를 얻기 위해서는 추가 연구를 통해서 더 많은 대상자를 선별하고 성별, 연령 및 치주 조건 등을 보다 세밀하게 보정하도록 하겠다.

본 연구는 채취 방법에 따라 특정 구강미생물 수의 검출 정도에 차이가 있음을 확인하였으며, 타액과 치면세균막을 이용해 구강미생물을 검출하는 방법이 치석을 이용하는 방법에 비해 치주질환을 일으키는 세균의 정량적 분석에 효과적일 수 있음을 보여준다.

본 연구는 구강미생물을 채취하는 다양한 방법에 따라, 미생물의 수를 정량적으로 분석, 비교하는 것이 의미 있는지를 확인하고자 하였으며, 다음과 같은 결론을 얻었다.

1. 타액과 치면세균막을 채취하여 분석하는 방법은, 치석을 이용하는 방법에 비해 Pg, Tf 포함하는 red complex의 구강미생물 수를 보다 효과적으로 검출할 수 있었다.

2. 타액을 채취하는 방법은 다른 방법에 비해 Sm의 정량적 분석에서 더 많은 구강미생물 수를 확인할 수 있었다.

3. 치주질환의 주요 원인균인 Pg, Tf 등은 대상자의 치주질환 유무에는 통계적으로 의미있는 구강미생물의 수적 차이를 확인하지 못했으나, 치아우식을 일으키는 Sm의 경우 건강한 그룹과 치주질환이 있는 그룹 모두에서 각 채취 방법에 따라 구강미생물의 수의 차이를 확인할 수 있었다.

본 연구는 구강미생물의 연구에 있어 다양한 채취 방법을 시도하는 것이 필요함을 보여주었고, 보다 효과적이고 표준화된 정량적 분석방법을 개발하고 이에 대한 정확성과 신뢰성을 향상시켜야 함을 확인시켜 주었다. 또한, 특정 구강미생물의 수적인 비교분석 연구에 기초자료로 이용될 수 있을 것으로 사료된다.

This work was supported by the National Research Foundation of Korea (NRF) grant funded by the Korea government (MSIT) (NRF-2021R1A2C2003160).

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